Ο σημαντικότερος και ιερότερος δρόμος που οδηγούσε στο Ιερό της Ελευσίνας. Είχε μήκος 22 χλμ και μέσο πλάτος 5 μέτρα. Ξεκινούσε από την Ιερά Πύλη στην περιοχή του Κεραμικού, κοντά στο Δίπυλο και τον Ηριδανό ποταμό.
Η Ιερά οδός ήταν κατά την αρχαιότητα ο δρόμος που ένωνε την πόλη των Αθηνών με την Ελευσίνα και το Θριάσιο Πεδίο, στο οποίο μία φορά το χρόνο τελούνταν τα περίφημα Ελευσίνια μυστήρια. Στο μεγαλύτερο τμήμα της ακολουθούσε την πορεία της σημερινής Ιεράς Οδού, περνούσε μεταξύ του Όρους Αιγάλεω και του Ποικίλου Όρους, καταλήγοντας στο Ιερό της Δήμητρας στην Ελευσίνα. Στην αρχαιότητα οποιοσδήποτε δρόμος που ένωνε το άστυ με κάποιο περιφερειακό ιερό, συνήθιζε να αποκαλείται «Ιερά Οδός». Η αθηναϊκή αρχαία Ιερά Οδός φέρεται να είχε την ονομασία «Ελευσινιακή».
Σύμφωνα με τα ευρήματα των ανασκαφών, κατά τη διάρκεια της χρονικής περιόδου μεταξύ των Κλασσικών έως και των Ρωμαϊκών χρόνων στην Ιερά Οδό κατασκευάσθηκαν τουλάχιστον οκτώ επάλληλα οδοστρώματα και η πορεία της σχεδόν ταυτίζεται με τη σύγχρονη οδική αρτηρία (που εκτείνεται από την Οδό Πειραιώς έως την Ελευσίνα), έχοντας κάποιες μικρές παρεκκλίσεις.
Σύμφωνα με ιστορικά στοιχεία, θεωρείται ότι οι κάτοικοι της Αθήνας, διέσχισαν την πορεία αυτή για πρώτη φορά κατά την υστεροελλαδική περίοδο (1600-1100π.χ.) προκειμένου να προσεγγίσουν τον οικισμό της Ελευσίνας. Αργότερα, η λατρεία της θεάς Δήμητρας στους χώρους της Ελευσίνας, που χρονολογείται ότι ξεκίνησε περίπου τον 11ο π.χ. αιώνα και από τον 8ο αιώνα π.χ. και μετά που καθιερώθηκαν επίσημα τα Μεγάλα Μυστήρια (Ελευσίνια μυστήρια), η αρχαία Ιερά οδός, διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο, με τις λατρευτικές πομπές να ακολουθούν αυτή τη διαδρομή.
Κατά το δεύτερο μισό του 6ου αιώνα, επί του τυράννου Πεισίστρατου και των γιων του, η Ελευσίνα ενσωματώθηκε στο αθηναϊκό κράτος, το ιερό της έγινε ευρέως γνωστό σε πανελλήνιο επίπεδο και ολοκληρώθηκε η διαμόρφωση της Ιεράς Οδού. Η χρήση της Ιεράς Οδού όμως συνεχίστηκε επί πολλούς αιώνες αργότερα, καθώς ο δρόμος εξυπηρετούσε τη σύνδεση του οικισμού της Ελευσίνας και των γύρω χωριών με την Αθήνα.